雙抗體夾心法

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。

3.　加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。

4.　加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

5.　終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

試劑

（1）　包被緩沖液（PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液）:

Na2CO3 1.59克

NaHCO3　 2.93克

加蒸餾水至1000ml

（2）　洗滌緩沖液（PH7.4PBS）：0.15M

KH2PO4 　0.2克

Na2HPO4·12H2O　2.9克

NaCl　8.0克

KCl　0.2克

Tween-20　0.05%　0.5ml

加蒸餾水至1000ml

（3）　稀釋液：

雞血清白蛋白（BSA） 0.1克

加洗滌緩沖液至100ml

或以雞血清等血清與洗滌液配成5～10%使用。