免疫測(cè)定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)，所以任何優(yōu)質(zhì)的診斷試劑離不開優(yōu)質(zhì)的原料，如抗原抗體，酶等。以前用于免疫測(cè)定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動(dòng)物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過各種化學(xué)合成方法制備。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結(jié)合物等免疫測(cè)定試劑幾成為現(xiàn)實(shí)的新一代試劑，各種新型使用的測(cè)定方法也不斷出現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中表達(dá)。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中狂犬病毒抗原（RV Ag）相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與HRP標(biāo)記的抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中病毒抗原的存在與否。

標(biāo)本要求

1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）

2. 加樣：分別在陰、陽性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行